2009年，「K氏病毒」（K Virus，簡稱KV）、原本是研發出來用以治療癌症的基因改良病毒，在進行人體臨床試驗一段時間之後，開始產生類似狂犬病的意外副作用，並失控造成大規模傳染。除了造成世界上90%人口的死亡外，也使得約9%的人口變成狂暴、嗜血但體能驚人的變種夜行怪物（又譯為「黑暗獵人」），與僅有1%的倖存者，會因體內產生自然抗體而不發病。前軍方病毒學家羅伯·奈佛（Robert Neville，威爾·史密斯 飾）因為體內有自然抗體而未受到感染，而成為紐約市唯一的倖存者，甚至曾一度認為自己就是全世界唯一倖存的人類。他獨自一個人據守在荒煙蔓草中的紐約曼哈頓，身旁只有愛犬珊曼莎（Samantha）和M4卡賓槍為伴，除了一面自立求生存之外，並努力研發這種傳染病毒的解藥。

因為一次偶然的遭遇，奈佛發現了變種人在日間的藏匿據點。他為了獲得研發疫苗的過程中所需的人體實驗素材，設下陷阱捕捉到一名女性變種人，卻也因此注意到原本一度被認為是徹底失去人類智能與社會能力、只依照生物第六感追緝令行動的變種人，似乎也有意識與思考能力。之後奈佛因為大意不慎誤陷變種人以一樣的手法所設置的陷阱而受傷昏迷，而錯失了在日落之前趕回藏匿處的時機。在與變種人和受感染的惡犬正面衝突的過程中，莎曼珊因為捨身救主而被感染了KV，奈佛在不得已的情形下，狠下心在牠完全喪失心智之前親手殺了愛犬。

失去了心靈上的唯一依靠讓奈佛陷入絕望，並不顧危險在夜間出門與變種人激烈衝突作為發洩，就在他失手即將命喪變種人首領手中之際，突然被聞訊趕來的安娜（Anna，艾莉絲·寶嘉 飾）與伊森（Ethan，查理·他罕 飾）所拯救。來自巴西聖保羅、原本曾是紅十字會工作人員的安娜是無意間收到奈佛平日發出的調幅廣播，而特地自馬里蘭州北上紐約尋找奈佛，並希望繼續北上尋找隱藏在北方佛蒙特州森林中、由倖存的人類所建立的難民營。雖然在安娜等人的拯救下奈佛暫時逃過一劫，卻也因此洩漏了藏匿地的位置，引來大批變種人在入夜之後包圍襲擊。縱使預先埋放了包括汽車炸彈在內的各項防禦措施，但是奈佛等人仍然無法抵擋變種人的襲擊而被逼退到最後防線的地下實驗室內，就在絕望之際，奈佛發現先前施打在女性變種人身上的疫苗似乎在低溫下發揮了治療的作用，於是他將實驗對象的血液樣本託付給安娜，將兩人藏匿在安全之處，並犧牲自己的性命與突破最後防線的變種人首領同歸於盡。事後，生還下來的安娜與伊森母子兩人成功地找到了倖存者的營地，他們除了成功地確保奈佛的研究成果得以繼續之外，也將奈佛的故事流傳了下來，而使他成為日後人類所傳頌的傳奇。